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Jun 12, 2023

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 3286 (2022) Citar este artículo

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Para mejorar nuestra comprensión de los circuitos neuronales es fundamental desarrollar interfaces multimodales mínimamente invasivas capaces de registrar y modular simultáneamente la actividad neuronal. Los dispositivos recientes se han centrado en igualar la distensibilidad mecánica del tejido para reducir las respuestas inflamatorias. Sin embargo, se necesitan reducciones en el tamaño de las interfaces multimodales para mejorar aún más la biocompatibilidad y las capacidades de registro a largo plazo. Aquí se presenta un diseño de microsonda coaxial multimodal con una huella mínimamente invasiva (de 8 a 14 µm de diámetro en longitudes milimétricas) que permite una interrogación eléctrica y óptica eficiente de redes neuronales. En el cerebro, las sondas permitieron mediciones eléctricas robustas y estimulación optogenética. Se pueden utilizar estrategias de fabricación escalables con diversos materiales eléctricos y ópticos, lo que hace que las sondas sean altamente personalizables según los requisitos experimentales, incluida la longitud, el diámetro y las propiedades mecánicas. Dada su insignificante respuesta inflamatoria, estas sondas prometen permitir una nueva generación de dispositivos multimodales fácilmente sintonizables para una interfaz mínimamente invasiva a largo plazo con circuitos neuronales.

Las grabaciones con microelectrodos son el estándar de oro para medir la actividad de neuronas individuales con alta resolución temporal en cualquier región del sistema nervioso y son fundamentales para definir el papel de los circuitos neuronales en el control del comportamiento. Los conjuntos de microelectrodos, como los de Utah o Michigan, han permitido el seguimiento de la actividad neuronal distribuida con una precisión de milisegundos1,2. Sin embargo, su gran tamaño y rigidez provocan daños en los tejidos e inflamación que dificultan los registros a largo plazo3,4. Las sondas Neuropixel y de fibra de carbono de última generación han mejorado estos dispositivos anteriores al aumentar la densidad de los electrodos y reducir las dimensiones y la rigidez de la sonda5,6,7. Aunque estas sondas han avanzado en el campo de la interfaz neuronal, los dispositivos de próxima generación deberían permitir una estimulación dirigida además de registros eléctricos colocalizados3,8. Las técnicas optogenéticas permiten la modulación de alta velocidad de la actividad celular mediante la expresión dirigida y la activación de opsinas sensibles a la luz9. Sin embargo, dadas las fuertes propiedades de dispersión de la luz y alta absorción del tejido neural, la interfaz optogenética con circuitos neurales profundos generalmente requiere la implantación de fibras rígidas de gran diámetro, lo que puede hacer que este enfoque sea más invasivo que su contraparte eléctrica10,11,12.

La sonda neuronal ideal combinaría modos ópticos y eléctricos manteniendo dimensiones de sección transversal pequeñas y longitudes ajustables. La capacidad de interactuar bidireccionalmente con circuitos y tipos de neuronas genéticamente definidos es clave para, en última instancia, poder comprender cómo el sistema nervioso calcula y controla el comportamiento. También es fundamental para determinar la base mecanicista de los trastornos sensoriomotores, definiendo cómo la actividad del circuito se ve afectada por una lesión y cómo podría restaurarse o facilitarse. Los enfoques para integrar modalidades ópticas y eléctricas han variado desde agregar fibra óptica a los conjuntos de Utah existentes hasta el Optetrode u otras estructuras coaxiales electroópticas integradas13,14,15,16,17. Estas tecnologías se han mostrado muy prometedoras para grabaciones eléctricas simultáneas y estimulación óptica in vivo. Sin embargo, la necesidad de reducir el espacio que ocupa el dispositivo para minimizar las respuestas inmunitarias en grabaciones de larga duración sigue presente3,18,19,20,21.

En este trabajo, presentamos, hasta donde sabemos, la sonda neural coaxial multimodal más pequeña con un canal eléctrico de baja impedancia que rodea un pequeño núcleo central de fibra óptica. Estas sondas electroópticas mecánicamente flexibles (EO-Flex) se pueden fabricar con diámetros tan pequeños como 8 µm y longitudes de hasta varios milímetros utilizando núcleos de guía de ondas de microfibra óptica o incluso diámetros más pequeños con núcleos de nanofibra óptica. También se pueden conectar directamente a fibras monomodo (SMF) para crear interfaces ópticas desmontables de baja pérdida que se pueden conectar directamente a hardware optogenético estándar. El rendimiento simultáneo de grabación eléctrica y estimulación óptica de las sondas EO-Flex se demuestra en el cerebro de un ratón. Nuestros experimentos muestran que el canal eléctrico de metal poroso proporciona una excelente capacidad de grabación incluso con el pequeño tamaño de la sonda. Las bajas pérdidas ópticas de fuente a punta de <10 dB permiten una estimulación optogenética sólida en ratones transgénicos o transducidos viralmente que expresan opsinas en células diana. Los estudios de implantes muestran respuestas inmunes mínimas, lo que sugiere que la sonda totalmente personalizable y las futuras matrices de alta densidad deberían permitir una interfaz a largo plazo con una mínima alteración del tejido neural circundante.

Las sondas EO-Flex se fabricaron utilizando núcleos ópticos de microfibras y nanofibras (ver Métodos). Aquí, nos centraremos en las microfibras de sílice producidas en masa como núcleo que permite sondas con longitudes superiores a 3 mm manteniendo un diámetro de <12 µm (Fig. S16a). Sin embargo, el protocolo de fabricación es general y se puede utilizar con otros núcleos ópticos, incluidas guías de ondas de nanofibras de óxido metálico de longitud de onda inferior, para producir sondas ultraminiaturizadas (Fig. S3). Para permitir un acoplamiento eficiente al hardware optogenético, las microfibras se colocaron primero sobre un sustrato de silicio, con un extremo de la fibra sobresaliendo del borde del sustrato, y luego se acoplaron a tope a un SMF escindido (Fig. 1a). Utilizamos alineación activa para maximizar la superposición de modos entre la microfibra y SMF. El acoplamiento se bloqueó utilizando una gota de adhesivo óptico curable con UV en el extremo del SMF (Fig. 1b).

a Se colocan microfibras de sílice de longitud definida sobre un sustrato de silicio para permitir que una férula cargada con fibra monomodo (SMF) se una a la microfibra. b (de arriba a abajo) Las fotografías muestran el proceso activo de alineación y unión del acoplamiento de la microfibra al SMF. c Esquema de la configuración de electrodeposición para depositar poli(3,4-etilendioxitiofeno)poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) después de la pulverización catódica de óxido de iridio (IrOx). d Imagen óptica de la salida de luz de una sonda desde el costado cuando la luz se refleja en un espejo y desde la faceta del extremo escindido (recuadros ampliados) con y sin luz láser. (recuadro) Imagen de fluorescencia que captura el ángulo del cono de la sonda después de sumergirla en una solución de tinte y lanzar luz azul (442 nm) dentro de la sonda. Se generaron micrografías a lo largo de un par de experimentos. e Micrografía electrónica transversal de una sonda EO-Flex después de fresar el extremo que muestra los anillos conductores expuestos junto con el núcleo de vidrio óptico (SiOx). Se registraron múltiples micrografías electrónicas para sondas similares que dieron como resultado propiedades similares. f Datos EIS para sondas fresadas con (línea negra) y sin (línea verde) revestimiento PEDOT:PSS. La impedancia promedio se muestra y el área ligeramente sombreada representa una desviación estándar para n = 4 sondas. g Una vista en sección transversal de la sonda que muestra sus diversas capas de revestimiento. h Fotografía de una sonda EO-Flex completa con un acercamiento de la región de la punta de microfibra. Para estrategias de escala, consulte la Fig. S16.

Para crear una interfaz desmontable robusta para pruebas in vivo, se insertó el SMF en una férula de cerámica. El extremo distal del conjunto de férula se pulió a máquina para permitir el acoplamiento a un cable de conexión (Fig. 1g, h). Son posibles otros diseños de interfaz para diferentes aplicaciones (Fig. S16). Para formar una capa eléctricamente conductora de bajo ruido alrededor de la punta de la sonda, se pulveriza una capa de óxido de iridio (IrOx) de 379 ± 43 nm sobre las microfibras, seguida de una capa de poliestireno de poli (3,4-etilendioxitiofeno) de 362 ± 137 nm depositada electroquímicamente. sulfonato (PEDOT:PSS) (Fig. 1c)22. La naturaleza porosa de IrOx permitió una mejor adhesión de la capa conductora PEDOT:PSS y mejora el rendimiento eléctrico general de la sonda. La sonda se pasivaba con 1,76 ± 0,16 µm de parileno-C para aislar eléctricamente la sonda y proporcionar una superficie biocompatible (Fig. S2). Para exponer las superficies eléctricas y ópticas, se utilizó un haz de iones enfocado para cortar la punta (Fig. 1e; ver Información de respaldo). La Figura 1g muestra el diseño final de la sonda y la Figura 1h muestra una fotografía de una sonda completa. Mediante la combinación de IrOx y PEDOT: PSS, se lograron impedancias eléctricas de <1 MΩ a 1 kHz a partir de áreas de electrodos de <15 µm2 (Fig. 1f).

Las propiedades ópticas de las sondas se evaluaron primero al obtener imágenes del ángulo del cono de salida en una solución de tinte (Fig. 1d, recuadro), que mostró un ángulo de divergencia de 10 a 15 °. Es importante destacar que, después de colocar las capas de revestimiento en la sonda, no se observa luz dispersada detectable desde la interfaz de microfibra/SMF (Fig. 1d) en comparación con la sonda previa al revestimiento (Fig. 1b). Las pérdidas ópticas entre un cable de conexión acoplado por láser y la salida EO-Flex se cuantificaron utilizando tres longitudes de onda diferentes (473, 543, 600 nm) y todos los dispositivos mostraron <7 dB (n = 4). Estos valores coinciden bien con los resultados simulados para una desalineación del modo de ~2 µm en el manguito de la férula (Fig. S1). La espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) se realizó en las sondas mientras estaban sumergidas en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Todas las sondas fabricadas y probadas mostraron una impedancia eléctrica promedio de 844 ± 179 kΩ a 1 kHz (n = 4; Fig. 1f y Fig. S2a-d) después de la deposición del revestimiento y fresado de la punta, en comparación con> 10 MΩ antes de la deposición de PEDOT.

Para confirmar que las sondas EO-Flex permiten mediciones eléctricas de alta sensibilidad in vivo, realizamos grabaciones extracelulares simultáneas e imágenes de dos fotones en la corteza de ratones anestesiados con isoflurano con células marcadas con fluorescencia (ver Información de respaldo)23,24. Este enfoque permitió monitorear la inserción y el movimiento específico de la sonda a través del tejido (Fig. 2a). Las sondas penetraron fácilmente en la duramadre expuesta con un pandeo mínimo cuando se utilizó inmersión en agua (Video S1) y alcanzaron las regiones objetivo en la capa cortical ópticamente accesible 2/3 (Fig. S12 y Video S2). Cuando se montó en un micromanipulador de tres ejes, fue posible realizar un ajuste fino de la posición lateral de la punta de la sonda, una vez dentro del tejido, para optimizar la relación señal-ruido y apuntar a neuronas individuales. Sin embargo, el movimiento lateral normalmente se limitaba a <30 µm. Usando este enfoque, adquirimos actividad endógena de unidades únicas y múltiples (Fig. 2b). Se utilizaron el análisis de componentes principales (PCA) y la agrupación gaussiana de registros eléctricos para determinar el número de unidades distintas (Fig. 2c). Las tasas de aumento se calcularon utilizando un algoritmo Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) aplicado a toda la duración de la grabación (Fig. 2d)25. La Figura 2b-e muestra una grabación representativa. Utilizando una sonda EO-Flex de ~ 1 mm de largo, también obtuvimos registros eléctricos de áreas corticales más profundas hasta la longitud máxima de las sondas. La firma eléctrica de estos registros sugiere que se puede acceder a todas las capas corticales (Fig. S4).

a Esquema que muestra la configuración utilizada para mediciones eléctricas guiadas visualmente. Se utilizaron imágenes de dos fotones de la sonda en relación con células marcadas con fluorescencia (ver Métodos) para rastrear su movimiento a través del tejido y optimizar la posición de grabación. (recuadro) Vista transversal ampliada de la preparación quirúrgica para obtener imágenes y registros eléctricos simultáneos. b Ejemplo de grabación EO-Flex que muestra actividad neuronal espontánea en la capa cortical 2/3 (profundidad = 250 µm) de un ratón anestesiado con isoflurano. El umbral (línea roja) que define un pico se estableció en \({{{{{\rm{Umbral}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\left( \frac{\left|{{{{{\rm{Recording}}}}}}\right|}{0.675}\right)\) basado en literatura publicada36. (región encuadrada) Un extracto de un segundo de la grabación muestra actividad de varias unidades. c Gráfico de análisis de componentes principales (PC) de la agrupación de formas de onda utilizando métodos de agrupación establecidos37. d La tasa de aumento durante el registro de 1 minuto que se muestra en (b) se calculó utilizando una estimación del núcleo bayesiano. e Formas de onda promedio (líneas continuas) junto con una desviación estándar (regiones sombreadas) para cuatro grupos determinados por PCA a partir del registro en (b).

A continuación, para demostrar la capacidad de las sondas EO-Flex para registrar la actividad evocada periféricamente, las insertamos en la corteza del barril, que recibe información sensorial de los bigotes en el lado opuesto del cuerpo. Mientras avanzábamos la sonda hacia el cerebro, periódicamente desviamos los bigotes usando bocanadas de aire mientras el animal todavía estaba bajo anestesia con isoflurano. Una vez que se observó la actividad correlacionada, se bloqueó la posición de la sonda (inserción de ~900 µm) y se apagó la anestesia. Las mediciones comenzaron entre 30 y 60 minutos después de que los animales comenzaran a caminar. Se utilizaron grabaciones de video para verificar las desviaciones de los bigotes mediadas por la bocanada de aire y registrar el comportamiento de batido espontáneo bajo iluminación infrarroja (Fig. 3a-c). Además, la actividad locomotora del ratón se registró utilizando un codificador óptico conectado a la cinta de correr esférica en la que se colocó al animal. Los bigotes se desviaron utilizando varias frecuencias de pulso (2, 3 y 5 Hz) y anchos (20 y 50 ms) (Fig. 3f-q), lo que provocó aumentos dependientes del estímulo en la frecuencia de picos, que fueron más pronunciados durante los períodos de descanso. (es decir, en ausencia de batido espontáneo). Para corroborar aún más el posicionamiento de la sonda en la corteza del barril, realizamos estimulaciones eléctricas mediadas por la sonda EO-Flex (pulsos bifásicos de 0 a 300 µA a 100 Hz), lo que resultó en desviaciones de los bigotes dependientes de la amplitud de la corriente (Fig. S5).

a Esquema de la configuración experimental. Los bigotes se desviaron mediante estímulos de soplo de aire administrados a través de una micropipeta conectada a un sistema de presión controlado por un generador de funciones (Picospritzer). El generador de funciones también controlaba un LED infrarrojo para la sincronización de datos analógicos y de vídeo. b Fotograma de vídeo que muestra al animal en reposo antes de la desviación de los bigotes. La flecha azul indica un bigote de ejemplo. El círculo rojo indica la ubicación del LED infrarrojo. c Fotograma de vídeo que muestra la desviación del bigote indicado durante la administración de una bocanada de aire. d Ejemplo de grabación EO-Flex (negro) durante la estimulación de bigotes de 3 Hz (amarillo). e Formas de onda promedio ordenadas con picos correspondientes con una desviación estándar sombreada. Las distintas formas de onda neuronales están marcadas con diferentes colores. f – h Gráfico ráster que muestra la actividad provocada por el estímulo de los bigotes para una frecuencia de estimulación de 2 Hz (ancho de pulso de 50 ms) (f), histograma de tiempo de periestímulo (g) y estimación BAKS de la frecuencia de disparo (h). i – k Gráfico ráster (i), histograma de tiempo de periestímulo (j) y estimación BAKS para una estimulación de 3 Hz (ancho de pulso de 50 ms). l – n Gráfico ráster (l), histograma de tiempo de periestímulo (m) y estimación BAKS (n) para estimulación de 5 Hz (ancho de pulso de 50 ms). o – q Gráfico ráster (o), histograma de tiempo de periestímulo (p) y estimación BAKS (q) para estimulación de 3 Hz (ancho de pulso de 20 ms). Panel (a) creado con Biorender.com.

Para demostrar la capacidad de las sondas EO-Flex para evocar ópticamente la actividad neuronal y al mismo tiempo grabar eléctricamente con la misma sonda, realizamos experimentos en ratones Thy1-ChR2-YFP anestesiados con expresión del canal iónico activado por luz azul Canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas. . Se insertaron sondas en la capa cortical 2/3 bajo control visual. Se acopló a la sonda un láser de estado sólido bombeado por diodo (DPSS) de 473 nm, adecuado para excitar ChR2, y los parámetros de estimulación se barrieron sistemáticamente (Figs. S6, S8, S9). Variamos la frecuencia de estimulación (10 a 50 Hz), el ancho del pulso (0,6 a 9,8 ms) y la potencia de salida (5 a 208 µW) para determinar la configuración óptima para excitar las neuronas que expresan ChR2. Utilizando el análisis de formas de onda en la actividad eléctrica registrada simultáneamente, encontramos que se requería una potencia mínima de 29 µW (2849 mW mm-2) para disparar las células en sincronía con el tren de pulsos ópticos (Fig. S6). En el registro de ejemplo que se muestra en las Fig. 4a-b, PCA combinado con un ajuste gaussiano mixto para la agrupación de los datos produjo dos agrupaciones primarias (Fig. 4c) con dos formas de onda diferentes (Fig. 4d) que ocurren durante el período de estimulación (Fig. .4e-g). Encontramos una interferencia mínima (p. ej., efecto Becquerel) entre los canales ópticos y eléctricos proximales, como se demostró al probar los dispositivos EO-Flex en animales no transgénicos con potencia óptica máxima y frecuencias de estimulación similares (Fig. S10). Se demostró una validación adicional de la ausencia del efecto Becquerel retrayendo la sonda EO-Flex lejos de las neuronas que expresan ChR2, o colocándola en una solución tampón, mientras se bombea ópticamente a una potencia láser similar (208 µW) utilizando los mismos trenes de pulsos optogenéticos. (Figura S11). A esta potencia máxima, los circuitos neuronales respondieron con un retraso temporal mínimo (Fig. S6f) y pudieron seguir estímulos de frecuencia de hasta 40 Hz antes de luchar por mantener el disparo sincronizado (Fig. S9).

a Actividad neuronal evocada ópticamente utilizando un tren de pulsos de 20 Hz (barras azules) de luz de 473 nm (ancho de pulso de 4,95 ms) con una potencia punta de 61 µW con ciclos de encendido y apagado a 1 Hz. La línea de umbral (roja) se estableció como se define36 en la Fig. 2. b Gráfico de tasa de picos para el registro en (a). c Gráfico del componente principal (PC) para la actividad neuronal evocada ópticamente. Los grupos separados tienen colores diferentes. d Formas de onda promedio (línea continua verde o negra) para cada grupo en (c) junto con una desviación estándar (región sombreada). e Cada grupo (negro o verde coordinado por colores) se representa a lo largo del tiempo junto con la ventana de un solo pulso (barra azul). f Estimación del suavizado bayesiano del kernel de la tasa de picos para cada período de estimulación. g Gráfico ráster coloreado que muestra la aparición de formas de onda de (d). h Tasa de pico promedio calculada durante la duración de 1 s de un solo ciclo de pulsación.

La capacidad de las sondas EO-Flex para evocar ópticamente la actividad neuronal se verificó aún más mediante imágenes de calcio de dos fotones en ratones Vglut2-GCaMP6f inyectados con un vector AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (ver Métodos). De cuatro a cinco semanas después de la inyección cortical, se insertaron sondas EO-Flex en las regiones de la capa 2/3 que expresan la opsina C1V1 activada por luz verde. Se conectó un láser DPSS de 556 nm a la sonda EO-Flex y se barrieron los parámetros de estimulación mientras se monitoreaban simultáneamente los transitorios de calcio neuronal. Los pulsos ópticos administrados provocaron picos de calcio correlacionados en las neuronas positivas para C1V1 dentro del campo de visión (Fig. S12). La evocación óptica exitosa de la actividad neuronal también se verificó mediante registros eléctricos simultáneos (Fig. S12e). Juntos, nuestros datos in vivo demuestran la capacidad de las sondas EO-Flex para registrar eléctricamente y modular ópticamente la actividad neuronal en el cerebro intacto.

Las sondas EO-Flex permiten apuntar y arrastrar células que expresan opsina a velocidades de activación que oscilan entre 10 y 50 Hz (Fig. S9). Si bien la potencia mínima (29 µW) para activar neuronas de manera confiable es mayor que en informes anteriores (1–10 mW mm-2)15,26,27, cabe señalar que debido al pequeño núcleo óptico de las sondas EO-Flex ( 3,6 µm), y la absorción y dispersión de la luz anticipada desde el tejido, se espera que intensidades más altas creen volúmenes de iluminación que sean lo suficientemente grandes y fuertes para reclutar neuronas con éxito en comparación con las fibras ópticas convencionales de núcleo más grande. Las simulaciones de Monte Carlo en la Fig. S6b indican que con una potencia de estimulación de 29 µW, la densidad de potencia óptica cae por debajo del umbral optogenético de 1 mW mm-2 a aproximadamente 1,2 mm de la punta. Incluso con la potencia de estimulación máxima utilizada en nuestros experimentos optogenéticos (208 µW o 20,435 mW mm-2 en la punta de la sonda), no observamos ningún efecto celular adverso (p. ej., cambios sostenidos en la velocidad de activación o los niveles de calcio) (Fig. S10). –12). Estudios recientes han sugerido que la exposición óptica continua con potencias <0,25 mW no produce efectos de la temperatura sobre la actividad neuronal (es decir, señales eléctricas degradadas durante el período de estimulación)28. Para garantizar aún más efectos mínimos de calentamiento óptico en el tejido neural, utilizamos anchos de pulso cortos y potencias ópticas de menos de 250 µW (Figs. S6-10). Se esperan efectos de calentamiento mínimos al utilizar estos parámetros de iluminación, lo cual se verificó aplicando modelos de calentamiento previamente validados a las sondas EO-Flex (Fig. S7b)29.

A continuación, evaluamos la respuesta del cerebro a la implantación de la sonda. Se implantaron sondas EO-Flex en la corteza de ratones heterocigotos Cx3cr1-GFP con microglía marcada durante 6 y 30 días. Se insertó una fibra multimodo de 250 µm de diámetro, comúnmente utilizada en experimentos optogenéticos, usando las mismas coordenadas estereotáxicas pero en el hemisferio opuesto para comparar. Se prepararon secciones cerebrales en serie que incluían ambos sitios de implantación. Los cortes de tejido se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-GFAP y anti-NeuN para cuantificar la astrogliosis reactiva y la pérdida neuronal, respectivamente (n = 4 ratones; N = 8 secciones por ratón) (Fig. 5 y Figs. S14, 15). El día 6 después de la implantación, encontramos que la fibra multimodo provocó una pérdida neuronal significativa, un aumento de 2,08 ± 0,23 veces en el número de microglia y un aumento de 2,68 ± 0,60 veces en los niveles de GFAP (Fig. 5e-g). Por el contrario, las sondas EO-Flex no mostraron una disminución significativa en las células NeuN positivas ni un aumento en el número de microglías o niveles de GFAP alrededor del sitio de inserción (Fig. 5e-g). El día 30 después de la implantación, se observó nuevamente pérdida neuronal para la fibra multimodo de control implantada, así como un aumento de 2,33 ± 0,27 veces en el número de microglia y un aumento de 2,81 ± 0,63 veces en los niveles de GFAP (Fig. 5l-n). . Por el contrario, las sondas EO-Flex no mostraron una disminución significativa en las células NeuN positivas ni un aumento en los niveles de GFAP, sino un pequeño aumento en el número de microglia (Fig. 5l-n). Estos resultados indican que las respuestas del tejido a la inserción o movimiento de la sonda EO-Flex durante el período de implantación son insignificantes en los momentos en que las respuestas inflamatorias suelen ser más prominentes, y considerablemente más pequeñas en comparación con las sondas estándar utilizadas para experimentos optogenéticos30. Finalmente, dada esta respuesta inmune mínima, también realizamos registros crónicos hasta 30 días después de la implantación de la sonda EO-Flex. Estas grabaciones revelaron excelentes relaciones señal-ruido en todos los momentos investigados (días 0, 1, 2, 6 y 30) (Fig. S13).

a, b Imágenes ópticas que muestran secciones coronales del cerebro de 20 µm de espesor alrededor de los sitios de implantación de la fibra multimodo (a) y la sonda EO-Flex (b). Tanto la fibra multimodo (diámetro, 250 µm) como la sonda EO-Flex (diámetro, 12 µm) se avanzaron hasta una profundidad de ~1 mm en la corteza. Las imágenes se tomaron 6 días después de la implantación en ratones heterocigotos Cx3cr1-GFP con microglía marcada (verde). Las secciones se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-NeuN (azul) y anti-GFAP (magenta) para marcar neuronas y astrocitos, respectivamente. c, d Imagen de mayor resolución de una región ampliada de (a, b) donde se ubicaron las puntas de la sonda. e – g Análisis de población (n = 16 secciones de dos animales) que muestra el impacto de la fibra multimodo o la implantación de la sonda EO-Flex en el número de células neuronales (e), la reactividad de los astrocitos medida por el nivel de expresión de GFAP (f) y la reactividad de la microglia medido por el número de células microgliales (g) para la implantación de 6 días. Las respuestas celulares se cuantificaron y promediaron en dos regiones de análisis de 150 µm × 1 mm que flanqueaban cada sitio de inserción. Para distinguir la cirugía de las respuestas tisulares relacionadas con la sonda, se realizó una craneotomía adicional de tamaño comparable 0,7 mm lateral a cada sitio de implantación del dispositivo. Se utilizó el mismo enfoque de análisis para cuantificar las respuestas celulares en este sitio de cirugía simulada. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. h, i Imágenes ópticas de la sección coronal del cerebro tomadas 30 días después de la implantación de la fibra multimodo (h) y la sonda EO-Flex (i). j, k Imagen de mayor resolución de una región ampliada de (h) e (i) donde se ubicaron las puntas de la sonda. l – n Análisis de población correspondiente (n = 16 secciones de dos animales) que muestra el número de células neuronales (l), la reactividad de los astrocitos (m) y la reactividad de la microglía (n) para la implantación de 30 días. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. Se utilizó la siguiente convención para indicar los valores de P: “ns” indica P > 0,05, “*” indica 0,01 < P ≤ 0,05, “**” indica 0,001 < P ≤ 0,01 y “***” indica 0,0001 < P ≤ 0,001. Todos los gráficos de barras se presentan como media ± sem.

En resumen, informamos sobre la fabricación de microsondas coaxiales multimodales y demostramos su capacidad para estimular ópticamente y registrar eléctricamente desde circuitos neuronales intrínsecos con una interferencia mínima entre las dos modalidades. El tamaño reducido y la alta relación de aspecto de las sondas EO-Flex permiten una interfaz mínimamente invasiva con los circuitos neuronales. Es posible una mayor reducción de tamaño con este diseño coaxial utilizando núcleos de fibra óptica más pequeños; sin embargo, la compensación es un aumento en las pérdidas ópticas y la impedancia eléctrica (Fig. S3). Aunque las capacidades de las sondas solo se probaron en el cerebro, como plataforma con excelente control sobre el diámetro y la longitud de la sonda, la elección de materiales de revestimiento con diversas composiciones químicas, flexibilidad mecánica inherente y una ruta clara para aumentar las densidades de las sondas (p. ej., Al traducir el proceso de deposición de revestimiento en haces de fibras) (Fig. S16c), esta tecnología debería encontrar aplicaciones inmediatas como interfaces mínimamente invasivas en diversas regiones del sistema nervioso, incluida la médula espinal y los nervios periféricos.

Desarrollar sondas que puedan llegar a regiones cerebrales aún más profundas es sencillo con los protocolos de fabricación desarrollados, ya que se puede generar prácticamente cualquier longitud de microfibra (Fig. S16a). Sin embargo, para un conjunto dado de capas de revestimiento, la rigidez de la sonda disminuye con la longitud. Por lo tanto, las sondas más largas podrían requerir tácticas adicionales para superar las bajas fuerzas de pandeo durante el proceso de inserción (por ejemplo, recubrimientos de azúcar solubles o capas de polímero rígido)31. Alternativamente, una incisión quirúrgica en la duramadre podría facilitar la inserción de la sonda. Independientemente de la longitud de la sonda, nuestros estudios de implantación demostraron que las sondas EO-Flex de tamaño pequeño tienen una respuesta inmune drásticamente reducida en comparación con las fibras multimodo estándar.

Se generaron microfibras de sílice (núcleo y diámetro total: 3,63 ± 0,31 µm y 5,60 ± 0,42 µm, respectivamente) con longitudes que varían entre 500 µm y 1 cm a partir de haces de fibra óptica sanguijuelas (Schott, n.º de pieza 1573179). Después de la escisión, las fibras individuales se dispersaron sobre un sustrato de silicio. Se usó una aguja de tungsteno montada en un micromanipulador de tres ejes para colocar las microfibras cerca del borde del sustrato con un extremo de la fibra suspendido a >100 µm del borde.

Para permitir un acoplamiento óptico eficiente de la guía de ondas al hardware optogenético estándar, se eligió una fibra monomodo (SMF) (Thorlabs S405-XP) con un diámetro de campo modal (2,8–3,4 µm) ligeramente más pequeño que el núcleo de microfibra. Para crear una interfaz desmontable robusta para pruebas in vivo, el SMF se insertó en una férula de cerámica (Thorlabs CF126-10) y se aseguró en su lugar con epoxi de curado rápido (DevCon #20445). Luego, los conjuntos de férula se pulieron a máquina hasta que se observó una interfaz de acoplamiento suave a través de un telescopio de inspección de fibra (Thorlabs, FS200), y el extremo opuesto de la fibra (para el acoplamiento a la guía de ondas) se cortó usando una punta de rubí (Thorlabs S90R). El conjunto de férula se montó en una plataforma de tres ejes y el extremo grabado se maniobró dentro de una gotita de adhesivo óptico curado con UV (Norland Optical Adhesivo 81) hasta que se formó una pequeña gotita en el extremo. Se logró un acoplamiento eficiente entre SMF y micro/nanofibra mediante alineación activa bajo un microscopio óptico vertical (Nikon; software: Amscope v3.7.9229.20170607) equipado con un objetivo 0,4 NA 20x después de acoplar una fuente de láser He-Ne de 544 nm en el SMF. Después de maximizar el acoplamiento de potencia en la guía de ondas traduciendo el SMF, el adhesivo NOA 81 se aseguró exponiéndolo a luz ultravioleta (línea de 325 nm de un láser HeCd) durante 30 s mientras se movía continuamente el haz alrededor de la gota.

Antes de depositar la capa metálica, los conjuntos de sonda se colocaron en un soporte de bloque de aluminio personalizado para enmascarar la parte inferior del casquillo donde se acopla la luz al conjunto. Esto aseguró que la interfaz de acoplamiento óptico estuviera enmascarada durante la metalización. Este bloque se colocó sobre una placa giratoria dentro de una cámara de pulverización catódica (Denton Discovery 18). Se depositó una fina capa de adhesión (<10 nm) de titanio (2,5 mTorr, 5 s, 200 W), seguida de una capa de 300 nm de espesor de óxido de iridio (IrOx) (12 mTorr, 15 min, 100 W, 5 sccm O2). flujo) o 500 nm de platino (Pt) (2,5 mTorr, 20 min, 200 W). Se eligió el óxido de iridio por su capacidad de inyección de carga ~3 veces mayor en comparación con las capas de platino convencionales y su naturaleza porosa, que aumenta la superficie electroquímica de la capa metálica32.

En conjunto, estos procedimientos produjeron conjuntos de férulas para montaje repetible en una configuración de imágenes y optogenética in vivo (Fig. 2). En la figura S16 se muestran diseños de interfaz alternativos (por ejemplo, para conjuntos de sondas).

Para reducir aún más la impedancia eléctrica de las sondas, se depositó una capa de poli(3,4-etilendioxitiofeno)-poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) sobre el IrOx. Las sondas se sumergieron (~100 µm de la punta de la sonda) en una solución 0,01 M de EDOT (97 %, Millipore-Sigma) con 2,5 mg/ml de poli(estirenosulfonato de sodio) (PSS; Millipore-Sigma). La deposición electroquímica se realizó utilizando un contraelectrodo de alambre de platino y un electrodo de referencia Ag/AgCl (CHI 111 P, CH Instruments) conectado a un potenciostato electroquímico (VersaSTAT4) que opera en modo galvanostático configurado para funcionar con una corriente de 200 nA durante 5 –30 s. Esto produjo una capa de polímero de 362 ± 137 nm de espesor (Fig. 1e y Fig. S2). Luego, las microfibras recubiertas con PEDOT-IrOx (o PEDOT-Pt) se pasivaron con 1,5 a 2 µm de parileno-C mediante deposición química de vapor (SCS Labcoater Deposition System; Specialty Coating Systems).

Se utilizó un haz de iones enfocado (FEI Scios Dual-beam) ajustado a 5 nA a 30 kV para cortar el extremo de la sonda y exponer los canales eléctricos y ópticos, revelando un diámetro final de la sonda de 8 a 12 µm para los núcleos de microfibra. . La espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) se llevó a cabo con Versastat4 (ejecutando VersaStudio v.2.60.6) para determinar la impedancia de la sonda en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X utilizando los mismos electrodos de referencia y contraelectrodos descritos anteriormente. La eficiencia del acoplamiento óptico se determinó midiendo la salida de luz de un cable de conexión de fibra óptica (Thorlabs, P1405B-FC-5) utilizando tres fuentes de luz (473, 543 y 673 nm) acopladas indistintamente en el cable. La potencia luminosa se midió colocando el casquillo a una distancia de 5 a 10 mm del cabezal del detector de un medidor de potencia digital (Thorlabs, PM100D). Luego se deslizó una funda de férula de cerámica (Thorlabs, ADAL1) hasta la mitad del cable de conexión y se deslizaron diferentes sondas EO-Flex en el extremo opuesto para acoplar la luz. La potencia luminosa de la punta de las sondas EO-Flex se midió utilizando un protocolo similar al del cable de conexión.

Todos los procedimientos con animales vivos se realizaron siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Salk bajo el protocolo número 13-00022. Para experimentos optogenéticos y electrofisiológicos combinados, utilizamos ratones macho Thy1-ChR2-YFP (n.º de stock 007612; Jackson Laboratories; edad: 10 meses); Para experimentos combinados de imágenes de calcio, optogenética y electrofisiológica, utilizamos ratones macho Vglut2-GCaMP6f inyectados con AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (un cruce personalizado entre ratones Vglut2-Cre knock-in y Ai95D; stock # 028863 y # 024105, respectivamente ; Laboratorios Jackson; edad: 3 meses); para la respuesta inmune y todos los demás estudios, utilizamos ratones macho heterocigotos Cx3cr1-GFP (número de stock 005582; Jackson Laboratories; edad: 9 semanas).

Los procedimientos quirúrgicos siguieron estrictamente los protocolos previamente establecidos33,34. Brevemente, se extrajeron pipetas de vidrio de pared delgada con un extractor de micropipetas Sutter Flaming/Brown (modelo P-97). Las puntas de las pipetas se cortaron en un ángulo agudo con un aumento de 10x utilizando técnicas estériles. Los diámetros de las puntas eran típicamente de 15 a 20 μm. Se descartaron las pipetas que no presentaban biseles agudos ni tenían diámetros de punta mayores. Se hicieron marcas milimétricas en cada aguja extraída para medir el volumen de virus inyectado en el cerebro.

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (4% para inducción; 1–1,5% para mantenimiento) y se colocaron en un sistema estereotáctico asistido por computadora con lectura de coordenadas digital y orientación por atlas (Angle Two, Leica). La temperatura corporal se mantuvo entre 36 y 37 °C con un controlador de temperatura de CC y se utilizó un ungüento oftálmico para evitar que los ojos se secaran. Se utilizó una pequeña cantidad de crema depilatoria (Nair) para eliminar el vello en el lugar de la incisión cutánea designado. La piel se limpió y esterilizó con un exfoliante de dos etapas con betadine y etanol al 70%. Se realizó una incisión en la línea media que comenzó justo detrás de los ojos y terminó justo después de pasar la sutura lambda. Se abrió el cuero cabelludo y se limpió el periostio con un bisturí y unas pinzas para exponer el hemisferio deseado para calibrar el atlas digital y marcar las coordenadas. Una vez que se colocaron los puntos de referencia (bregma y lambda) usando la punta de la pipeta y se ingresaron en el programa, se estableció el objetivo deseado en el atlas digital. La pipeta de inyección se movió con cuidado al sitio objetivo (coordenadas: AP −1,5 mm, ML 1,5 mm). A continuación, se marcó el sitio de la craneotomía y se utilizó un microperforador eléctrico con una broca estriada (punta de 0,5 mm de diámetro) para adelgazar una parte del hueso de 0,5 a 1 mm de diámetro sobre el sitio de inyección objetivo. Una vez que el hueso estuvo lo suficientemente delgado como para flexionarse suavemente, se usó una aguja estéril de 30 G con una jeringa adjunta para cortar y levantar con cuidado un pequeño segmento de hueso (0,3 a 0,4 mm).

Para la inyección, se pipeteó cuidadosamente una gota del virus sobre parafilm (1-2 μl) para llenar la aguja de inyección extraída con el volumen deseado. Una vez cargada con un volumen suficiente, la aguja de inyección se bajó lentamente hacia el cerebro hasta alcanzar la profundidad objetivo (DV 0,2 mm). Se aplicó presión manual utilizando una jeringa de 30 ml conectada mediante un tubo retráctil y se inyectaron lentamente 0,4 μl del vector AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (6,1E + 12 VP/mL; sin diluir; UNC Vector Core) durante 5 a 10 minutos. mín. Una vez inyectado el virus, se bloqueó la válvula de presión de la jeringa. La posición se mantuvo durante aproximadamente 10 minutos para permitir que el virus se propagara y evitar el reflujo al retirar la aguja. Después de la inyección, se suturó la piel a lo largo de la incisión. Los ratones recibieron Buprenex SR subcutáneo (0,5 mg por kg) y se les permitió recuperarse antes de colocarlos en su jaula. Se permitió que el vector se expresara durante 4 a 5 semanas antes de las grabaciones in vivo.

Los procedimientos quirúrgicos siguieron de cerca los protocolos establecidos23,35. Brevemente, se anestesió a los ratones con isoflurano (4 a 5 % para inducción; 1 a 1,5 % para mantenimiento) y se les implantó una placa de cabeza en una cama quirúrgica personalizada (Thorlabs). La temperatura corporal se mantuvo entre 36 y 37 °C con un sistema de control de temperatura DC y se utilizó un ungüento oftálmico para evitar que los ojos se secaran. Se utilizó crema depilatoria (Nair) para eliminar el vello en el sitio designado de la incisión en la piel. La piel se limpió y desinfectó a fondo con un exfoliante de dos etapas con betadine y etanol al 70%. Se extirpó quirúrgicamente una porción del cuero cabelludo para exponer los segmentos del cráneo frontal, parietal e interparietal. Los bordes del cuero cabelludo se unieron a los lados laterales del cráneo utilizando un adhesivo compatible con tejidos (Vetbond; 3 M). Se fijó al cráneo una placa de metal mecanizada a medida con cemento dental (n.º de catálogo H00335; Coltene Whaledent), lo que permitió estabilizar la cabeza con un soporte personalizado. Los ratones recibieron Buprenex SR (0,5 mg/kg) antes del alivio de la anestesia y se les permitió recuperarse durante al menos tres días antes de continuar con la preparación.

Para registros electrofisiológicos y de imágenes combinados, se realizó una craneotomía de ~ 2 mm × 4 mm de diámetro sobre el área objetivo (p. ej., el sitio de inyección del vector AAV). La duramadre que recubre la corteza se mantuvo intacta. El movimiento del tejido se controló cubriendo el tejido expuesto con una solución de agarosa al 1% y un cubreobjetos. El cubreobjetos se fijó al cráneo con Vetbond (3 M) y cemento dental. Para permitir la entrada de la sonda en la corteza, la agarosa y el cubreobjetos se cortaron en un lado para que quedaran al ras con la craneotomía. Las grabaciones comenzaron inmediatamente después de la preparación de la ventana óptica. La profundidad de la anestesia se controló durante todo el experimento y se ajustó según fuera necesario para mantener una frecuencia respiratoria de aproximadamente 55 a 65 respiraciones por minuto. Se complementó solución salina según fuera necesario para compensar la pérdida de líquido.

Para las mediciones electroópticas en condiciones de vigilia, primero se habituó a los ratones a un reposacabezas en una cinta rodante esférica (normalmente tres sesiones, 30 a 90 min/sesión, una sesión/día durante tres días consecutivos). Después de la habituación, se realizó una craneotomía de ~0,3 a 0,5 mm de diámetro sobre el área objetivo (corteza en barril; coordenadas: AP −1,0 mm, ML 3,0 mm) bajo anestesia general. Luego se transfirieron los ratones a la cinta rodante esférica y se les permitió recuperarse de la anestesia durante al menos 30 a 60 minutos, dependiendo del tiempo que habían pasado bajo anestesia. Después de las mediciones electroópticas, la sonda se bloqueó en su posición cubriendo primero la interfaz sonda/tejido con una solución de agarosa al 1% y luego aplicando Vetbond (3 M) y cemento dental, fijando así la férula al cráneo. A los ratones se les permitió recuperarse en su jaula antes de realizar grabaciones posteriores en días diferentes.

Para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las sondas EO-Flex in vivo, realizamos registros extracelulares de unidades únicas y múltiples en la corteza de ratones despiertos y anestesiados con isoflurano, similar a nuestro trabajo anterior23,24. El canal eléctrico de las sondas EO-Flex se conectó al terminal positivo de una etapa principal de alta impedancia (amplificador de CA con microelectrodo modelo 1800, AM Systems) utilizando un adaptador personalizado, mientras que el terminal negativo y tierra se conectaron a un cable Ag/AgCl insertado. encima de la corteza cerebelosa. El adaptador constaba de un bloque cerámico con un extremo de cable de conexión integrado y un clip de cobre extraíble soldado a un cable de escenario de cabezal de un solo núcleo. Las sondas EO-Flex se acoplaron con este adaptador deslizando una funda de casquillo en el extremo del cable de conexión, deslizando la sonda en este conjunto y luego bajando el clip de cobre para hacer contacto con la capa metálica en el casquillo EO-Flex.

Para permitir la inserción de tejido específico y el posicionamiento preciso de la sonda, el adaptador se montó en un micromanipulador motorizado (MP-225, Sutter Instrument Company) orientado en un ángulo definido con respecto al cráneo (p. ej., ~60 grados para imágenes combinadas y electrofisiología). , y ~0 grados para mediciones sin imágenes). Después de colocar la punta de la sonda EO-Flex cerca del borde de la craneotomía, se pipetearon unas gotas de solución salina fisiológica en la abertura del cráneo para facilitar la inserción mecánica a través de la interfaz del tejido (Fig. 2a).

Se ayudó a lograr un posicionamiento preciso pasando la salida del amplificador diferencial a través de un altavoz para que sirviera como retroalimentación auditiva para la proximidad de la sonda a las células activas. La señal sin procesar del electrodo se amplificó, se filtró (corte bajo, 300 Hz; corte alto, 5 kHz; ganancia, 1000 ×), se digitalizó (20 kHz; usando DAQExpress 2.0) y se almacenó en el disco para su análisis fuera de línea. . El posicionamiento de la punta de la sonda cerca de los cuerpos celulares neuronales se vio favorecido aún más por la retroalimentación visual en experimentos que involucraban imágenes en ratones transgénicos que expresaban indicadores fluorescentes.

La estimulación eléctrica (Fig. S5) implicó la entrega de pulsos de corriente mediada por sonda EO-Flex (amplitud de 0 a 300 µA, frecuencia de estimulación de 100 Hz, ancho de pulso de 0,2 ms, período de estimulación de 1 Hz) con un estimulador de pulso aislado (Modelo 2100; AM Systems ) conectado a un generador de funciones.

La corteza cilíndrica de un hemisferio determinado recibe información sensorial de los bigotes ubicados en el lado opuesto del cuerpo. Para desviar los bigotes contralaterales a la ubicación de grabación de la sonda, aplicamos bocanadas de aire con una micropipeta conectada a través de un tubo de plástico a un sistema de presión controlado por un generador de funciones (Picospritzer III; Parker Hannifin Co.). El generador de funciones también operaba un LED infrarrojo colocado fuera del campo de visión del animal pero dentro del campo de visión de la cámara de video para sincronizar los datos analógicos y de video. La micropipeta se conectó a un micromanipulador motorizado (MP-225, Sutter Instrument Company), lo que permitió un control preciso sobre los bigotes que se estimulaban. La presión del aire se dirigió lejos de la piel y los ojos y se administró en dirección rostracaudal. Los estímulos de las bocanadas de aire consistieron en 2 s "encendido" seguido de 2 s "apagado", con diferentes frecuencias de pulso (2 a 5 Hz) y anchos (20 a 100 ms).

Las imágenes in vivo se realizaron23,33 utilizando un microscopio objetivo móvil (Sutter Instrument Company) equipado con un láser Ti:Zafiro pulsado de femtosegundo (Chameleon Ultra II, Coherent), dos canales de detección de fluorescencia (filtros de emisión: ET525/70 M y ET605/ 70 M (Chroma); divisor de haz dicroico: 565DCXR (Chroma); tubos fotomultiplicadores: H7422-40 GaAsP (Hamamatsu)) y software de adquisición de imágenes MPScope (laboratorio Kleinfeld, UCSD). La longitud de onda de excitación del láser se ajustó a 920 nm. La potencia promedio del láser fue <10–15 mW en la superficie del tejido y se ajustó con la profundidad para compensar la pérdida de señal debido a la dispersión y la absorción. Se utilizó un objetivo de inmersión en agua de 16 × 0,8 NA (CFI75, Nikon) o 40 × 0,8 NA (LUMPLFLN, Olympus) para la entrega y recolección de luz. La actividad del calcio espontánea y evocada ópticamente se registró en planos ópticos cerca de la punta de la sonda (velocidad de fotogramas, 8,14 Hz). Para minimizar los artefactos mediados por el efecto Becquerel en las grabaciones eléctricas, la potencia del láser de imágenes se mantuvo al mínimo. Para registrar transitorios de calcio evocados ópticamente en experimentos optogenéticos, sincronizamos la velocidad de cuadros de la imagen con la entrega del tren de pulsos ópticos y ajustamos la fase de modo que las regiones frente a la punta de la sonda se escanearan cuando el láser DPSS estaba apagado (Fig. S12).

Para excitar ChR2 o C1V1, respectivamente, se conectó a la sonda la luz de un láser DPSS (CNI) de 200 mW, 473 o 556 nm, modulada directamente por una señal de generador de funciones externa. El acoplamiento ligero a la sonda se logró deslizando el extremo pulido de la férula dentro de una funda de cerámica y luego deslizándolo sobre el extremo de un cable de conexión de fibra personalizado. Cada prueba de estimulación duró alrededor de 60 s, con los 5 a 10 s iniciales designados para registrar la actividad espontánea antes de que se entregara el tren de pulsos ópticos (potencia de estimulación, 6 a 208 µW; ancho de pulso, 0,6 a 9,8 ms; frecuencia de estimulación, 10 a 50 ms). Hz; duración, 1 s; intervalo entre estímulos, 1 s entre trenes de pulsos).

A ratones heterocigotos Cx3cr1-GFP (machos, 9 semanas de edad) con microglía marcada se les implantó una sonda EO-Flex y una fibra multimodo de 250 μm de diámetro adecuada para la estimulación cerebral profunda optogenética en hemisferios opuestos (± 1,45 mm desde la línea media). Para la implantación, se utilizó un microtaladro eléctrico con una broca estriada (punta de 0,5 mm de diámetro) para adelgazar una parte del hueso de 0,5 a 1 mm de diámetro. Una vez que el hueso estuvo lo suficientemente delgado como para flexionarse suavemente, se usó una aguja estéril de 30 G con una jeringa adjunta para cortar y levantar con cuidado un pequeño segmento de hueso (0,3 a 0,4 mm). La sonda o fibra multimodo se avanzó a través de esta abertura bajo control visual hasta una profundidad de aproximadamente 1 mm utilizando un sistema estereotáctico asistido por computadora (Angle Two, Leica). Se utilizó cemento dental para fijar los dispositivos en su lugar. La unión firme del cemento dental al cráneo se facilitó escarificándolo con un raspador de huesos (Fine Science Tools). Para distinguir la cirugía de las respuestas tisulares relacionadas con la sonda, realizamos craneotomías adicionales 0,7 mm lateralmente desde los sitios de implantación del dispositivo (Figs. S14, S15). Para evaluar las respuestas inflamatorias de los tejidos, los ratones se sacrificaron 6 o 30 días después de la implantación del dispositivo mediante asfixia con CO2 siguiendo las pautas de la IACUC. La perfusión transcardial se realizó con sacarosa al 10% en PBS, seguida de PFA al 4% recién preparada en PBS. Ambos hemisferios se fijaron posteriormente en PFA al 4% en PBS durante la noche y posteriormente se infiltraron en sacarosa al 30% en PBS durante un día y se congelaron instantáneamente en un medio de congelación de tejidos TBS. Los hemisferios implantados se crioseccionaron coronalmente a 20 μm, se secaron al aire durante la noche y posteriormente se procesaron para su tinción. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo, luego se lavaron en PBS Tween-20 al 0,1% y se incubaron durante dos horas a 22-24 °C en la oscuridad con anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforo. Las secciones se lavaron, se sellaron con Prolong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) y se almacenaron a 4 °C. Los anticuerpos primarios incluyeron anti-GFAP (monoclonal de ratón; EMD Millipore; cat. #MAB3402; RRID: AB_94844; dilución 1:250) y anti-NeuN (policlonal de conejo; EMD Millipore; cat. #ABN78; RRID: AB_10807945; 1:100 dilución). Los anticuerpos secundarios (1:100) incluyeron anti-conejo de cabra Alexa Fluor 405 (Thermo Fisher Scientific; cat. #A-31556; RRID: AB_221605) y anti-ratón de cabra Alexa Fluor 633 (Thermo Fisher Scientific; cat. #A-21052 ; RRID: AB_2535719). La obtención de imágenes confocales de secciones de tejido teñidas se realizó en un Zeiss LSM 710 (software: ZEN Black, Zeiss v2011). Se adquirieron pilas en z en mosaico de tres canales para producir imágenes de secciones de tejido completo (Fig. 5 y Figs. S14, S15). El tamaño de la imagen era de 1024 × 1024 píxeles unidos en 3 a 5 × 3 a 5 mosaicos. Las imágenes se tomaron con un objetivo compatible con aire Olympus 20 × 0,8 NA.

La actividad neuronal se consideró un pico si su amplitud cruzaba un umbral determinado por \({{{{\rm{Umbral}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\ left(\frac{{{{{{\rm{|Recording|}}}}}}}{0.675}\right)\) 36. Luego, todos los picos observados se clasificaron según los dos primeros componentes principales en grupos utilizando un ajuste gaussiano mixto con el número de conglomerados optimizados según la métrica de Calinksi-Harabasz para el análisis de conglomerados37 calculado en MATLAB (R2019b). Las tasas de activación promedio se calcularon utilizando Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) (v2017; https://github.com/nurahmadi/BAKS). Se utilizaron simulaciones de Monte Carlo para determinar el volumen de propagación y iluminación de la sonda EO-Flex a diferentes potencias (Fig. S6b).

Los perfiles de calentamiento optogenético se crearon utilizando modelos anteriores29 utilizando la ecuación de biocalor de Pennes. Los parámetros de simulación fueron para un radio óptico de sonda EO-Flex de 1,8 µm, una longitud de onda de 470 nm, una potencia de 1 mW o 208 µW y un radio cilíndrico de 10 µm para el promedio de temperatura en las simulaciones basadas en el tiempo (Fig. S7 ).

Los gráficos de peristímulo que correlacionan los estímulos ópticos con los eventos de picos se calcularon utilizando la optimización del ancho de banda del núcleo, que se ha demostrado que estima con precisión la tasa de picos subyacente (Fig. 4b)25.

El análisis de los datos de imágenes de calcio de dos fotones se realizó utilizando Suite2p (Fig. S12)38. Se observaron picos de calcio evocados ópticamente en planos ópticos cerca de la punta de la sonda. Nuestro análisis se centró en los planos ópticos en los que al menos tres regiones de interés (ROI) de tamaño celular respondieron consistentemente durante todo el período de estimulación.

Los datos de inmunotinción se procesaron, analizaron y trazaron utilizando el software ImageJ (v1.53f51), Imaris (v9.2; Oxford Instruments) y Prism (v8.4.3; GraphPad Prism). Todos los datos se representaron como media ± sem. Los tamaños de muestra del grupo se eligieron en función de estudios previos y análisis de poder. Las pruebas t pareadas de dos colas determinaron los valores de P. Se utilizó la siguiente convención para indicar los valores de P: “ns” indica P > 0,05, “*” indica 0,01 < P ≤ 0,05, “**” indica 0,001 < P ≤ 0,01 y “***” indica 0,0001 < P ≤ 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos originales se proporcionan con este documento. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código personalizado utilizado para procesar los datos y crear las figuras está disponible en GitHub (https://github.com/Spencer-W/EO-Flex-Algorithms.git). También estará disponible a través de los autores correspondientes previa solicitud.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a los Dres. Anis Husain y Rob Saperstein (Ziva Corporation) por discusiones técnicas y simulaciones electromagnéticas de los primeros prototipos y diseños de EO-Flex. También nos gustaría agradecer a Pavel Shekhtmeyster (Instituto Salk) por la asistencia técnica con los experimentos de optogenética, y a Ben Temple y Elischa Sanders (Instituto Salk) por sus consejos sobre el análisis de datos electrofisiológicos. Además, nos gustaría agradecer a Samir Damle (UCSD) por su discusión y ayuda con respecto a los procesos de sala limpia. Este trabajo fue patrocinado por el programa de Prescripciones Eléctricas (ElectRx) de la Oficina de Tecnologías Biológicas (BTO) de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) bajo los auspicios del Dr. Douglas Weber a través de la Subvención/Contrato No. HR0011-16-2 de la Oficina de Gestión de Contratos de DARPA. -0027 (a DJS, SE y AN). Este proyecto también fue apoyado por el Instituto Kavli para el Cerebro y la Mente de UCSD (Subvención No. 2018-1492 para DJS y AN) y los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01 NS108034, U19 NS112959 y U01 NS103522 para AN, y P30CA014195 para el Instituto Salk). Este trabajo se realizó en parte en la Infraestructura de Nanotecnología de San Diego (SDNI) de UCSD, miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología, que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (Subvención ECCS-1542148 para UC San Diego).

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Spencer Ward y Sadik Esener

Departamento de Nanoingeniería, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Conor Riley, Jenny Nguyen, Sadik Esener y Donald J. Sirbuly

Centro de Biofotónica Avanzada Waitt, Instituto Salk de Estudios Biológicos, La Jolla, CA, 92037, EE. UU.

Erin M. Carey y Axel Nimmerjahn

Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, 92093, EE. UU.

Donald J. Sirbuly

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SW, CR, SE, AN y DJS conceptualizaron las sondas; SW, CR y JN fabricaron, caracterizaron y probaron las sondas; SW, EMC y AN realizaron los experimentos biológicos; SE, AN y DJS obtuvieron financiación y supervisaron el estudio; SW, AN y DJS analizaron los datos y escribieron el artículo; Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Axel Nimmerjahn o Donald J. Sirbuly.

UC San Diego ha presentado una solicitud de patente sobre este trabajo (solicitud n.° 63/076,328), en la que SW, CR, SE, AN y DJS son coinventores. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Guosong Hong y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ward, S., Riley, C., Carey, EM y col. Microsondas coaxiales electroópticas mecánicamente flexibles para una interfaz mínimamente invasiva con circuitos neuronales intrínsecos. Nat Comuna 13, 3286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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Recibido: 10 de noviembre de 2020

Aceptado: 22 de abril de 2022

Publicado: 07 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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